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黄曲毒素（Aflatoxin），也称作黄曲霉素，是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止强的致癌物质。加热至280℃以上才开始分解，所以一般的加热不易破坏其结构。黄曲毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性强。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲毒素。
反应原理
本试剂盒采用直接竞争ELISA方法检测样本中的黄曲霉毒素B1，在微孔条上预包被上偶联抗原，利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行的，样本中的黄曲霉毒素B1和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样品中的黄曲霉毒素B1含量与样品的吸光度值呈反比，与标准曲线比较即可得出黄曲霉毒素B1含量。
试剂内容1、黄曲霉毒素B1酶标板（Microtiter well plate）：每条8孔，一板12条。
2、黄曲霉毒素B1标准品溶液（Aflatoxin B1 standard）：
0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb 各一瓶，1mL /瓶。
3、
5、底物液A（Substrate Solution A）：一瓶，6mL /瓶。6、底物液B（Substrate Solution B）：一瓶，6mL /瓶。
7、终止液（Stop Solution）：一瓶，6mL /瓶。
试剂套组使用说明
A、注意事项
1. 将待测样品、酶标板、标准品溶液、10倍浓缩洗涤液、酶结合物、底物液A、底物液B、终止液，在25℃环境下，至少回温40分钟。
2. 工作洗涤液配制（用于洗板）
利用蒸馏水将10倍浓缩洗涤液以1:9比例稀释（即 1 mL 10倍浓缩洗涤液 + 9 mL蒸馏水），即可作为清洗微孔使用的工作洗涤液。（10倍浓缩洗涤液请确实回温后使用，并请检查溶液底部之结晶是否完全溶解。）
3. 70%甲醇溶液配制
准确量取70ml甲醇，加入30ml去离子，即为70%甲醇溶液。配制好的甲醇溶液请尽快使用，若用不完请保存于2~8 ℃，请勿超过一星期。
4. 用剩余的测试条孔则放回铝箔袋中干燥保存，储存于2~8 ℃冰箱。保质期为12
个月。
B、未提供设备及试剂：
酶标仪（Microtiter plate spectrophotometer）：检测波长450nm，参考波长630nm
样数：10）
---取5g具有代表性的样品，用打碎机粉碎成过20目的样品，准确称取2g粉碎后样品；
---加入10ml 70%甲醇水（见配液3），强力振荡5分钟，再加入10ml去离子水，强力振荡5分钟，5000g离心10分钟后，取1ml上清液于2ml离心管中（注意：如检测样品为食用油时，取下层液作为检测液，并且取下层液时尽可能不要取到上层的油相，不然可能影响实验结果）；
---用1M HCl或1M NaOH调PH至7-8；
---取50μl进行分析；
注意：当样本检测吸光度值超出标准品范围时，请再次用35%甲醇水稀释，在计算时再乘上响应的稀释倍数即可。
D、操作步骤
1、于适当测试孔分别加入50 μL 标准溶液（0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb）；
；4、将测试孔中反应液甩掉，用洗涤工作液（250μL/孔）洗涤微孔板4-5次，
准品浓度取Ln，与相对应吸光值之B/B0（相对于0值标准品吸光值之百分比）做线性回归分析（semi-log），再将待测检体之B/B0值代入，则可推算出待测检体浓度。
Absorbance standard（or sample） B
× 100 = %
Absorbance（0 ppb standard） B0
本试剂盒的黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1）标准品检测下限为 0.1ppb，此浓度之吸光值与阴性标准溶液（0 ppb）之吸光值有明显的差异。检测上限为8.1ppb，超出此浓度之检体需经适量稀释后再进行检测。
G、交叉反应率(Cross-reactivity)
|
Compound |
B/B0 85% Cross-Reactivity（%） |
|
5 |
|
|
Aflatoxin M1（黄曲霉毒素M1） |
10 |
H、 样品敏感度(Sensitivity)及回收率(Recovery rate)
|
样品 |
检测下限（ppb） |
回收率（%） |
|
谷物、玉米、饲料、食用油 |
1 |
70-110 |
I、变异系数(CV%)
试剂盒板内变异系数小于8%，板间变异系数小于15%。
J、问答（注意事项）
1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。
i. 未加入酶结合物。
iii. 室温太低。
答: 若是温太低（< 19℃），请于操作步骤4，适度延长孵育时间（> 40分钟）。
iv. 未使用试剂盒之洗涤液清洗。
答: 请用试剂盒内所提供之洗涤液清洗。
v. 试剂盒已过有效期限。
答: 请更换仍在有效期限内之试剂盒。
vi. 终止实验后太久未判读。
答: 请于加入反应终止液后20分钟内判读。
2. 标准曲线线性不佳，与品管报告的曲线不一致，或是平行性不佳。
i. 孵育位置避光不确实或受到气流干扰。
答: 请确认孵育位置既不透光也不透风（如抽屉内）。
ii. 操作时间拖太久。
答: 请在方法熟练后再进行操作。
iii. 微孔间相互污染。
答: 加样品时，请小心勿溅出微孔外，造成其它微孔的污染。
iv. 标准品或酶结合物所加入的量不一致。
答: 请使用已校正过的加液枪，并确保其与枪头尖之间有高度密合性。
v. 添加样品或试剂的操作方法不正确。
答: 加样品或试剂时，枪头尖请勿接触微孔。
vi. 洗板过程发生问题（如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤）。
答: 请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。
3. 吸光值均偏高（或线性不够陡）。
i. 室温太高（> 25 ℃）。
答: 若无法降低室内温度，请适度缩短步骤4之反应时间（< 30分钟）。
ii. 底物（TMB）受到污染。
答: 若发现底物已呈现淡蓝色，请勿再使用。
iii. 反应时间超过太久。
答: 请确实控制反应时间。
iv. 酶结合物污染了盒内其它试剂。
答: 使用过之枪头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂
（特别是酶结合物与底物）接触过之容器应立即清洗干净（先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留）。
4. 阴性标准品之吸光值低于阳性标准品之吸光值。
i. 微孔中之试剂未能充分混合。